Yorktown rời Trân Châu Cảng ngày 20 tháng 4 năm 1941 cùng với các tàu khu trục Warrington, Somers và Jouett; hướng về phía Đông Nam, đi qua kênh đào Panama trong đêm 6 – 7 tháng 5, và đến Bermuda vào ngày 12 tháng 5. Từ lúc đó cho đến khi Hoa Kỳ tham gia chiến tranh, Yorktown thực hiện bốn chuyến tuần tra tại Đại Tây Dương, kéo dài từ Newfoundland đến Bermuda dài tổng cộng 28.392 km (17.642 dặm) để thực thi vai trò trung lập của Hoa Kỳ.

Cho dù Adolf Hitler đã ngăn cấm các tàu ngầm của ông tấn công tàu bè của Mỹ, những người chỉ huy trên các tàu chiến Mỹ đã không biết được chính sách này và đã hoạt động như thể đang trong thời chiến tại Đại Tây Dương.

Ngày 28 tháng 10, trong khi Yorktown, thiết giáp hạm New Mexico và các tàu chiến Hoa Kỳ khác đang bảo vệ một đoàn tàu vận tải, một tàu khu trục đã bắt được tín hiệu của một tàu ngầm và đã thả mìn sâu để tấn công, trong khi bản thân đoàn tàu vận tải phải chuyển hướng khẩn cấp về mạn phải, lần đầu tiên trong số ba lần thay đổi hành trình khẩn cấp trong chuyến đi. Chiều hôm đó, việc sửa chữa động cơ trên một trong những chiếc tàu vận tải trong đoàn, chiếc Empire Pintail, đã làm giảm tốc độ của đoàn tàu chỉ còn 11 knot (20 km/h).

Trong đêm, các tàu chiến Mỹ bắt được tín hiệu radio Đức khá mạnh, chứng tỏ có sự hoạt động của tàu ngầm ở khu vực lân cận. Chuẩn Đô đốc H. Kent Hewitt, chỉ huy lực lượng hộ tống, đã gửi một tàu khu trục đi càn quét phía sau đoàn tàu vận tải để tiêu diệt chiếc U-boat hay ít nhất cũng xua đuổi được nó.

Ngày hôm sau, trong khi những chiếc máy bay trinh sát thực hiện tuần tra bên trên, Yorktown và tàu tuần dương Savannah tiến hành tiếp nhiên liệu cho các tàu khu trục theo hộ tống, và công việc chỉ kết thúc khi trời sụp tối. Vào ngày 30 tháng 10, Yorktown chuẩn bị tiếp nhiên liệu cho ba tàu khu trục khi những tàu hộ tống khác bắt được tín hiệu âm thanh. Đoàn tàu vận tải sau đó phải thực hiện các cú chuyển hướng khẩn cấp trong khi các tàu khu trục Morris và Anderson thả các mìn sâu, còn chiếc Hughes hỗ trợ việc truy tìm đối phương. Anderson sau đó còn thực hiện hai đợt tấn công bằng mìn sâu, ghi nhận "có các lượng dầu loang đáng kể nhưng không thấy xác tàu."

Từng ngày trôi qua và khả năng chiến tranh ngày càng trở nên hiện thực. Tại một nơi khác cũng trong ngày 30 tháng 10, hơn một tháng trước khi máy bay Nhật Bản tấn công Trân Châu Cảng, chiếc U-562 đã phóng ngư lôi đánh chìm tàu khu trục Reuben James và gây thiệt hại nhân lực nặng nề – là tổn thất tàu chiến Mỹ đầu tiên trong Thế Chiến II.

Sau một chuyến Tuần tra Trung lập khác vào tháng 11, Yorktown trở về Norfolk vào ngày 2 tháng 12 và nó ở đấy khi năm ngày sau khi Mỹ bị lôi kéo vào Thế Chiến II.